Внедрение метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в лабораторную практику стало одним из наиболее важных событий в клинической лабораторной диагностике в последнее десятилетие. Принцип метода ПЦР был разработан в 1983 году сотрудником фирмы “Цетус” Кэри Мюллисом и в настоящее время широко используется как для научных исследований, так и для клинической диагностики в практическом здравоохранении.

В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое в пробирке с помощью фермента ДНК-полимеразы. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять ПЦР-анализ, как унифицированный метод лабораторных исследований. ПЦР - процесс протекающий в одной пробирке состоящий из повторных циклов амплификации (умножения, копирования) специфической молекулы ДНК с целью получения экспотенциального увеличения числа копий, которые могут быть выявлены имеющимися в наличии методами детекции. Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках, для этого используют один из ключевых и наиболее важных компонентов реакции “праймеры”- синтетические олигонуклеотиды, состоящие как правило из 20-30 оснований, комплементарных ”сайтам” (участкам) отжига (присоединения) на индетифицируемой матричной ДНК. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.

Каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий, протекающих при различных темпе-ратурах: денатурация, отжиг и удлинение. Во время 1-ой стадии- денатурации, происходит плавление ДНК при температуре 95 гр.С, при этом нити ДНК разъединяются и становятся доступными для праймеров. При отжиге (“anneling”) реакционная смесь охлаждается до температуры, оптимальной для присоединения “праймеров” к сайту нити ДНК. Праймеры присоединяются в направлении с 3”конца цепочки ДНК, как правило по одному на каждую цепь, таким образом достраивание новой цепи ДНК в последующих циклах происходит только в ограниченном праймерами участке ДНК. Следущая стадия - удлинение новой це-почки ДНК посредством присоединения имеющихся в реакционной смеси дез-оксирибонуклеотидтрифосфатов (dNTPs’) по принципу комплементарности (аденин-тимин, гуанин-цитозин, тимин-урацил). Удлинение начинается от праймеров и катализиируется ферментом ДНК-полимеразой при оптимуме температуры 72 гр.С. ДНК полимераза, используемая в современных методиках- Tag- полимераза, выделенная из термостабильных бактерий Termus aquaticus, живущих в горячих источниках, высоко стабильна и сохраняет активность до конца процесса амплификации.

Полимеразная цепная реакция протекает автоматически в программируемом термостате-термоциклере (амплификаторе). Трехступенчатый цикл, в результате которого получаются точные копии индентифицируемого участка матричной ДНК, повторяется 30-50 раз в соответствии с заданной программой термоциклера. С каждым новым циклом число молекул матричной ДНК удваивается, по завершении процесса количество копий нарастает в геометрической прогрессии. Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). Во время первого цикла удлинение новой цепочки от праймера происходит произвольно. В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n-число циклов, если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около миллиарда копий определенной последовательности ДНК.

- Метод позволяет обнаружить патогенные для человека бактерии и вирусы в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно.

- Для диагностики практически всех известных в настоящее время заболеваний может быть использован один набор приборов и незначительно различающиеся наборы реактивов для разных инфекций, что обусловлено химическим сродством нуклеиновых кислот. Появляется возможность создания для многих биологических жидкостей и возбудителей универсальной процедуры приготовления пробы, выделения ДНК и постановки реакции.

- Отпадает необходимость в средах, клеточных культурах, узкой специализации медицинского персонала. ПЦР-диагностикумы дают возможность избежать проблем связанных с перекрестно-реагирующими антигенами.

- Возможен анализ серонегативных пациентов на самых ранних стадиях инфекционного процесса, когда лечение наиболее эффективно.

- Легко определяются патогенные возбудители, для которых не разработаны или затруднены методы культивирования, а также персистирующие формы патогенных бактерий и вирусов с высокой изменчивостью, внутриклеточных паразитов.

- Метод позволяет поставить надежный диагноз в течение рабочего дня, то есть за 6-8 ч.

- Метод обладает высокой чувствительностью (до 1 копии возбудителя в пробе) и специфичностью (различают серологические штаммы).

- Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы.

- Возможна одновременная диагностика нескольких возбудителей заболевания в одной пробе.

- Возможно определение резистентности и чувствительности к антибиотикам.

- Метод ПЦР чрезвычайно эффективен для контроля за качеством лечения.

Одним из существенных преимуществ метода ПЦР является высокая чувствительность.